Spektrofotometrisk kolorimetrisk proteinkvantifisering
Proteiner er vanligvis en blanding av proteiner. Colorimetriske analyser er basert på proteinkomponenter: Aminosyrer (f.eks. Tyrosin, serin) reagerer med en ekstra kromogen gruppe eller fargestoff for å produsere et farget materiale. Konsentrasjonen av det fargede materialet er direkte relatert til antall aminosyrer som proteinet reagerer, og derved reflekterer proteinkonsentrasjonen.
Colorimetrisk metode
Det finnes flere metoder som BCA, Bradford og Lowry.
Lowry-metoden: Basert på tidligste Biuret-reaksjon og forbedret. Proteinet reagerer med Cu2 for å gi en blå reaksjon. Lowry-metoden er imidlertid mer følsom enn Biuret. Ulempen er behovet for å sekvensielt legge til flere forskjellige reagenser; reaksjonen tar lang tid; er utsatt for ikke-proteinstoffer; proteiner som inneholder EDTA, Triton x-100 og ammoniakksulfat er ikke egnet for denne fremgangsmåten.
Bicinchoniininsyreanalyse: Dette er en nyere, mer sensitiv proteinanalyse. Proteinet som skal analyseres reagerer med Cu2 i en alkalisk oppløsning for å produsere Cu, som danner et chelat med BCA for å danne en lilla forbindelse med en absorpsjons-topp ved 562 nm. Det lineære forholdet mellom konsentrasjonen av denne forbindelse og proteinet er sterk, og forbindelsen dannet etter reaksjonen er meget stabil. I forhold til Lowry-metoden er operasjonen enkel og følsomheten er høy. Likevel, lik Lowry-metoden, er det utsatt for forstyrrelser av proteiner og vaskemidler.
Bradford-metoden: Prinsippet med denne metoden er at proteinet reagerer med Coomassie Brilliant Blue for å produsere en farget forbindelse som absorberer ved 595 nm. Den største funksjonen er følsomheten, som er 2 ganger den for Lowry og BCA. Det er enklere og raskere. Det krever bare en slags reaksjonsreagens. Forbindelsen kan være stabil i 1 time for å lette resultatet; Forstyrrer Lowry, BCA reagerer med reduksjonsmidler (f.eks. DTT, merkaptoetanol) kompatibel. Det er imidlertid fortsatt følsomt for vaskemidler. Den største ulempen er at forskjellige standarder kan føre til store forskjeller i resultatene av den samme prøven og ingen sammenlignbare resultater.
Noen forskere som er utsatt for kolorimetriske målinger for første gang, kan bli forvirret av resultatene av de forskjellige kolorimetriske testene. Hva slags metoder tror du på å være forvirret? På grunn av det faktum at gruppene reagerte på forskjellige måter og de kromogene grupper ikke er de samme, brukes flere metoder samtidig for å gjøre prøvekonsentrasjonene av den samme prøven inkonsekvent. For eksempel beskriver Keller et al. testet proteinet i morsmelk og fant at konsentrasjonene målt av Lowry og BCA var signifikant høyere enn Bradfords. Forskjellen var betydelig. Selv om den samme prøven er bestemt, er standardprøven valgt med samme kolorimetriske metode inkonsekvent, og konsentrasjonen etter testen er også inkonsekvent. Bruk for eksempel Lowry til å teste proteinet i cellehomogenatet ved bruk av BSA som standard, med en konsentrasjon på 1,34 mg / ml og et globulin som standard med en konsentrasjon på 2,64 mg / ml. Derfor, før du velger en kolorimetrisk metode, er det foretrukket å referere til den kjemiske sammensetningen av prøven som skal testes, og finne et kjemisk lignende standardprotein som en standard. I tillegg gir den kolorimetriske metoden for kvantifisering av proteiner ofte problemer ved at absorbansverdien av prøven er for lav, noe som resulterer i en stor forskjell mellom den målte prøvekonsentrasjon og den faktiske konsentrasjon. Hovedspørsmålet er at fargen på den viktige delen av 1011 spektrofotometeret, kyvetten, har en viss halveringstid, så hver kolorimetriske metode viser reaksjonstidspunktet. Alle prøver (inkludert standardprøver) må testes innen denne tiden. Hvis tiden er for lang, blir den oppnådde absorbansverdien mindre og den konverterte konsentrasjonsverdien reduseres. I tillegg er reaksjonstemperaturen, pH-verdien av løsningen, etc., alle viktige faktorer som påvirker eksperimentet. I tillegg er det veldig viktig å bruke plastikmikrometri. Unngå bruk av kuvetter laget av kvarts eller glass fordi fargen etter reaksjonen vil føre til at kvarts eller glass blir farget, noe som resulterer i unøyaktig absorpsjon av prøven.
Selskapet spesialiserer seg på salg av spektrofotometre , velkomne kunder som har behov for å konsultere og kjøpe, vi vil gi deg oppriktige service- og kvalitetsprodukter, samt lavere priser.
E-post: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com