Introduksjon til prinsippet og anvendelsen av generelle komponenter i spektrofotometer

Spektrofotometer er mye brukt i biologisk, kjemisk, klinisk og miljømessig forskning.
Spektrofotometri måler hvor mye lys et kjemisk stoff kan absorbere ved å føre en lysstråle gjennom en prøve i et spektrofotometer.
Ved å måle den detekterte lysintensiteten, kan metoden brukes til å bestemme konsentrasjonen av løst stoff i prøven.
Konseptet med spektrofotometri
Strålen som sendes til prøven består av en fotonstråle.
Når fotonene møter molekylene i prøven, kan molekylene absorbere noen av dem, redusere antall fotoner i strålen og redusere intensiteten av deteksjonssignalet.
Overføringen er en del av lyset som går gjennom prøven. Det er definert som lysintensiteten som passerer gjennom prøven ved den innfallende lysintensiteten.
Absorbansen er motsatt av transmittansen, tilsvarende mengden målt av spektrofotometeret.
I henhold til absorbansen kan konsentrasjonen av løsningsprøven bestemmes ut fra Lambert-loven, som viser at det er et lineært forhold mellom absorbansen og prøvekonsentrasjonen. I følge øl-Lambert-loven er absorbans produktet av absorpsjonskoeffisient, som er et mål på mengden lys som absorberes av oppløst stoff i en gitt bølgelengde og avstanden som lys passerer gjennom. Prøve eller reiseavstand og konsentrasjon av løst stoff. Generelt er målet med å måle absorbans å måle konsentrasjonen av prøven.
Komponenter av spektrofotometer
Hvert spektrofotometer består av en lyskilde, en kollimator (linse eller en fokuseringsanordning for overføring av sterke og rette bjelker), en monokromator for å skille bjelker med forskjellige bølgelengder, og en lengdevelger for valg av bølge eller spor av ønsket bølgelengde. Bølgelengden til lyset som brukes i spektrofotometeret som er presentert i denne videoen, ligger i området for ultrafiolett og synlig lys. Spektrofotometeret inkluderer også en prøveholder, en fotodetektor og en skjerm som viser resultatene fra detektoren.
Det siste spektrofotometeret er direkte koblet til en datamaskin, der eksperimentelle parametere kan kontrolleres og resultatene vises.
Arbeidsprinsipp for spektrofotometer
Når du utfører spektrofotometri, er det viktig å ta passende forholdsregler, for eksempel å bruke hansker, avhengig av hvilken type biologisk eller kjemisk løsning du bruker.
Slå på enheten og la lampen og elektronikken varme opp før du måler UV-Vis-spekteret til prøven.
Forbered en tom prøve av samme løsning med samme pH og lignende ionestyrke, men uten komponentene som skal analyseres; siden kyvetten og løsningsmidlet kan spre lys, er det nødvendig å analysere prøven.
Den tradisjonelle spektrofotometerprøveholderen er designet for å holde plast- og kvartsskåler. Pipetter den opprinnelige løsningen i en bolle.
Etter å ha tørket av fingeravtrykk og sprutet dem på utsiden av bollen, sett kyvetten riktig inn i prøveholderen og lukk lokkedøren.
Glem aldri å lukke døren fordi UV-stråling fra et åpent spektrofotometer kan skade øynene og huden.
Programmer ønsket bølgelengde eller bølgelengdeområde som skal overføres til prøven. Dette avhenger av den beste bølgelengden som komponenten som analyseres kan absorbere. Maskinen nullstilles deretter ved å måle den blanke prøven, som trekker fra bunnens absorbans på grunn av prøvebufferen.
Avhengig av hvilken type spektrofotometri-eksperiment du gjør, kan det være nødvendig å generere en standardkurve før prøvemåling, hvorfra konsentrasjonen av forbindelsen analysert i prøven kan bestemmes.
La prøven oppnå riktig temperatur og bland forsiktig for å unngå å innføre bobler. Prøven kan deretter legges direkte i bollen inne i maskinen og en avlesning kan gjøres.
Etter at prøven er målt for absorbanse, beregnes eksperimentet riktig; for eksempel å bestemme konsentrasjons- eller enzymaktivitetsnivået.
Påføring av spektrofotometer
En av de vanlige bruksområdene til spektrofotometer er å måle celletetthet. Celletetthetsmåling kan brukes til å produsere den logaritmiske vekstkurven for bakterier, hvorfra det optimale tidspunktet for integrering av rekombinant protein kan bestemmes.
Spektrofotometeret kan også brukes til å måle den kjemiske reaksjonshastigheten. I denne utførelsesformen blir absorbansen brukt for å overvåke den enzymatiske reaksjonen, som forsvinner med tiden gjennom en mellomreaksjon på 452 nm. Hastigheten til dette enzymatiske trinnet kan beregnes ved å matche dataene med den aktuelle ligningen.
Innføringen av mikrospektrofotometer eliminerer behovet for prøveholder. Disse spektrofotometrene bruker overflatespenning for å opprettholde prøven.
Mikrospektrofotometer er det beste valget for å måle massen og konsentrasjonen til små og dyre prøver, for eksempel biomolekyler, inkludert proteiner og nukleinsyrer.
Absorpsjonen av proteiner ved 280 nm avhenger av innholdet av aromatiske sidekjeder som finnes i tryptofan, tyrosin og fenylalanin, samt disulfidbinding mellom de to cysteinene.
Konsentrasjonen av protein kan bestemmes av dens absorbanse ved 280 nm og dens absorpsjonskoeffisient, som er basert på sammensetningen av aminosyrer.
DNA og RNA har den maksimale absorbansen ved 260 nm, hvorfra konsentrasjonene deres kan bestemmes. Renheten av nukleinsyrer kan også evalueres fra forholdet mellom absorbansavlesninger og spesifikke bølgelengder.