Spektrofotometre har blitt rutinemessige instrumenter i moderne molekylærbiologilaboratorier. Ofte brukt til nukleinsyre, proteinkvantifisering og kvantifisering av bakterievekstkonsentrasjoner.
Enkelt prinsipp for spektrofotometer
Spektrofotometret bruker en lyskilde som kan generere flere bølgelengder, og passerer gjennom en serie spektroskopiske enheter for å generere en lyskilde med en spesifikk bølgelengde. Etter at lyskilden har passert prøven som skal testes, blir en del av lyskilden absorbert, og absorbans av prøven beregnet for derved å omdannes til en prøvekonsentrasjon. . Prøvens absorbans er proporsjonal med konsentrasjonen av prøven.
Kvantifisering av nukleinsyrer
Kvantifiseringen av nukleinsyrer er den mest brukte funksjonen til spektrofotometret. Oligonukleotider, enkeltstrenget, dobbeltkjedet DNA og RNA kan kvantifiseres i en buffer. Absorpsjonstoppen for den høyeste absorpsjonstoppen av nukleinsyre er 260 nm. Den molekylære sammensetningen av hver nukleinsyre er forskjellig, så konverteringsfaktorene er forskjellige. For å kvantifisere forskjellige typer nukleinsyrer, velg de tilsvarende koeffisientene på forhånd. For eksempel tilsvarer absorbansen av 1 OD 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNA og 30 μg / ml Olig. Absorbansen etter testen blir omdannet av de ovennevnte koeffisienter for å oppnå den tilsvarende prøvekonsentrasjonen. Før du tester, velg riktig prosedyre, skriv inn volumet av stamløsningen og fortynningsmidlet, og test deretter emnet og prøveløsningen. Eksperimentet var imidlertid ikke alltid glatt. Ustabile avlesninger kan være den største hodepinen for eksperimentøren. Instrumenter med høyere følsomhet viser større drift i absorbansen.
Faktisk tillater designprinsippet og arbeidsprinsippet til spektrofotometeret absorbansen å variere innenfor et visst område, det vil si at instrumentet har viss nøyaktighet og presisjon. For eksempel er nøyaktigheten til Eppendorf Biophotometer ≤1,0% (1A). Resultatene av slike flere tester varierer mellom ca. 1,0% av gjennomsnittet og er normale. I tillegg er det også nødvendig å vurdere de fysisk-kjemiske egenskapene til selve nukleinsyren og pH i bufferen der nukleinsyren er oppløst, ionkonsentrasjonen osv.: Når ionekonsentrasjonen er for høy under testen, leseskift, så det anbefales å bruke en viss pH-verdi og en lav ionekonsentrasjon. Buffere, som TE, stabiliserer avlesningene sterkt. Fortynningskonsentrasjonen av prøven er også en faktor som ikke kan ignoreres: på grunn av den uunngåelige tilstedeværelsen av noen fine partikler, spesielt nukleinsyreprøver, i prøven. Tilstedeværelsen av disse små partiklene forstyrrer testresultatene. For å minimere effekten av partiklene på testresultatene, kreves absorbansen av nukleinsyren å være minst større enn 0,1 A, og absorbansen er fortrinnsvis mellom 0,1 og 1,5 A. Innenfor dette området er interferensen av partiklene er relativt små og resultatet er stabilt.
Dette betyr at konsentrasjonen av prøven ikke skal være for lav eller for høy (utenfor fotometerets testområde). Til slutt bør driftsfaktorene, som blanding, være tilstrekkelig, ellers er absorbansverdien for lav, til og med negative verdier; blandingen kan ikke eksistere bobler, den blanke væsken har ingen suspendert materie, ellers drifter avlesningen drastisk; den samme kyvetten må brukes til å teste emnet og prøven. Ellers er konsentrasjonsforskjellen for stor; konverteringsfaktoren og prøvekonsentrasjonsenheten velges konsekvent; kyvetten med vindusslitasje kan ikke brukes; volumet av prøven må nå minimumsvolumet som kreves av kyvetten.
I tillegg til nukleinsyre-konsentrasjonen, viser spektrofotometeret også flere svært viktige forhold som indikerer renhet av prøven, slik som forholdet mellom A 260 / A 280, brukt for å vurdere prøvens renhet fordi proteinets absorpsjonstopp er 280 nm. En ren prøve med et forhold større enn 1,8 (DNA) eller 2,0 (RNA). Hvis forholdet er lavere enn 1,8 eller 2,0, indikerer det tilstedeværelsen av proteiner eller fenoliske stoffer. A 230 indikerer at noen forurensninger er til stede i prøven, så som karbohydrater, peptider, fenoler, etc., og forholdet mellom den renere nukleinsyre A 260 / A 230 er større enn 2,0. En 320 oppdager turbiditeten til løsningen og andre interferensfaktorer. For rene prøver er A 320 generelt 0.
Hangzhou Sumer Instrument Co., Ltd.
Legg til: No.168 Wuchang Ave., Yuhang District, Hangzhou 310023, Kina
TEL: + 86-571-88739859
Telefon: +8618658504900
E-post: info@sumerlab.com
Nett: sumerinstrument.com